萝卜涨价了 / 待分类 / Co-IP结果如何看?_Co-IP(免疫共沉淀)与G...

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2018-06-22  yh56.com

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Co-IP是检测分子间相互作用的常用技术,德泰发现有很多实验人员反映在查看论文文献的过程中,遇到Co-IP实验结果图不知道如何进行分析。本文从不同的文献中找了四个Co-IP的结果图,用案例的方式对如何分析Co-IP实验结果图进行介绍。

澳门美高梅开户平台:Co-IP结果如何看?

首先需要说明的是,熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及实验的操作流程是进行Co-IP结果图分析的前提。在清楚知道Co-IP操作流程的前提下,弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤,结合图中展示的结果进行分析,便可以看懂Co-IP的实验结果图。

Co-IP结果分析案例一


该图为验证蛋白EDR1与蛋白EDR4之间是否存在相互作用的结果图。由图中可以得到,蛋白EDR4带有GDP标签,蛋白EDR1带有FLAG标签,该实验为利用蛋白标签来沉淀和检测蛋白;该co-ip实验实验被分为两组,第一组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋白,第二组存在EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白;图中共有三组胶图,分别是Inut组,IP组,以及CO-IP组。基本情况得到之后,开始进行分析:

观察图片的顺序为Co-IP实验操作顺序相同。首先观察Input组,即阳性独照组。第一块胶图为利用anti-FLAG沉淀FLAG标签,发现两个条带都在130kd处有蛋白,说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋白且其大小为130kd,第二块胶图为利用anti-GFP标签沉淀GFP标签,发现第一条带在25kd存在蛋白而第二条带在130kd存在蛋白,说明第一组实验存在GFP标签,且大小为25kd,第二组实验存在EDR4-GFP蛋白且大小为130kd。随后观察IP组,该组图表示的是利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀,图上显示两组实验在130kd都存在蛋白,说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。最后观察CO-IP实验组,该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签,图上显示第一组实验没有条带,而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共沉淀下来,但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来了。说明EDR1-FLAG蛋白不能与GFP标签相互作用,但是可以与EDR4-GFP蛋白相互作用,由此可得到结论:EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用。

Co-IP结果分析案例二

该图为验证蛋白ChREBP与蛋白HDAC1之间是否存在互作的结果图。蛋白ChREBP带有FLAG标签,蛋白HDAC1带有Myc标签。该实验是利用标签抗体去沉淀及检测带有标签的蛋白。该实验共有三组,第一组为加Myc-HDAC1不加FLAG-ChREBP,第二组为加FLAG-ChREBP不加Myc-HDAC1,第三组为两个都加。实验共有四张胶图,分别为IB:Myc、IB:FLAG(这两张胶图为阳性对照),IP:FLAG IB:FLAG(IP组),IP:FLAG IB:Myc(Co-IP组),基本情况得到之后,开始进行分析:

最下面两个胶图为利用IB验证Myc-HDAC1及FLAG-ChREBP存在的阳性对照。第二张胶图表示的实验操作是利用anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白,图上显示经IB验证第二、第三组FLAG-ChREBP蛋白被成功沉淀下来,而第一组没有结果(第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白)。第一张胶图表示在anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白的基础进行IB检测验证Myc-HDAC1蛋白是否存在。图上显示第一、第二组实验没有检测到(第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白,第二组不存在Myc-HDAC1蛋白),但是第三组实验检测到了Myc-HDAC1蛋白。由此可以得到结论:两个蛋白都存在的时候,当FLAG-ChREBP蛋白被沉淀,Myc-HDAC1蛋白也会被共沉淀下来,ChREBP蛋白与HDAC1蛋白之间存在相互作用。

Co-IP结果分析案例三

该图为验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用的结果图。由图可以发现,该实验被分为两组:input组及IP组,有两块胶图,第一块是IB验证蛋白X的存在,第二块是IB验证蛋白Y的存在。由对照组的条带可以得到结论:蛋白X与蛋白Y都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验,结果蛋白X与蛋白Y没有被沉淀下来,说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合(阴性对照,用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性);IP组的第二条带表示利用蛋白X进行沉淀实验,结果蛋白X被沉淀下来,蛋白Y也被沉淀下来,由此得到结论:蛋白X-蛋白Y之间存在相互作用。

Co-IP结果分析案例四

该图为验证CAT3蛋白与CPK8蛋白之间存在相互作用的结果图。由图可以得到,两个蛋白分别加了标签,利用标签进行蛋白的沉淀及检测。实验共分三组,第一组为存在GFP-CAT3,不存在cMyc-CPK8;第二组为存在cMyc-CPK8不存在GFP-CAT3,第三组为两个都存在。实验共有两组胶图,一组为阳性对照组(Input组),另外一组为实验组(Output组)。由Input组可以得到结论:三组实验中的组分都是正确的。分析Output组发现:anti-cMyc在第二、第三条泳带都有,而anti-GFP只有第三条带有蛋白,由此推测实验组的实验操作为利用anti-cMyc进行沉淀实验,在利用IB检测GFP-CAT3的存在。从实验组第三条带可以发现当cMyc-CPK8蛋白被沉淀下来时GFP-CAT3蛋白也会被共沉淀下来,由此得到结论:cMyc-CPK8蛋白与GFP-CAT3蛋白存在相互作用。

Co-IP和GST pull-down的区别

Co-IP和GST pull-down都是用于检测蛋白相互作用的实验,两者有很多相似之处,如只能检测强相互作用、只能定量分析、不能检测瞬时相互作用等。同时两者在原理及实验操作上也存在一定的区别,下文就Co-IP和GST pull-down在原理及操作流程上的区别做一简述。

Co-IP和GST pull-down原理区别

GST pull-down方法的基本原理是:利用重组技术将探针蛋白与GST融合,融合蛋白通过GST与固相化的载体上的GTH亲和结合。因此,当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

GST pull-down实验原理图
Co-IP实验原理图

免疫共沉淀(Co-IP)原理为用某一蛋白的抗体,在细胞裂解液中与相应的蛋白(诱饵蛋白)结合,用Protein A/G将抗原抗体复合物拉下,最后在拉下的复合物中检测是否存在与诱饵蛋白相结合的目的蛋白。

Co-IP和GST pull-down实验操作区别

Co-IP实验为体内实验条件,蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行,其优点为可以避免人为影响,还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体,缺点是无法证明两个蛋白之间是直接的相互作用还是间接的相互作用;GST pull-down实验为外实验条件,可以去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。但由于其实验条件为非天然条件,可能会使实验结果出现假阳性,即因为电荷作用的影响造成的吸附,而不是生理性的相互作用。

  Co-IP GST pull-down
定性/定量检测 定性 定性
相互作用方式 直接或间接 直接
实验条件 体内 体外
蛋白是否需要加标签
是否需要抗体 是,目的蛋白和诱饵蛋白的抗体 是,目的蛋白抗体,用于WB检测

表1:Co-IP实验与GST pull-down实验比较

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